Quels facteurs affecteront l'absorbance?

1. Que sont l'absorbance et la transmittance?

Le reste de la lumière est transmis, autrement dit, il traverse l'objet, ce qu'on appelle la transmission (T).
Plus il y a d’analyte dans la solution, plus la transmission est faible, car plus elle absorbe de lumière.

2. Pourquoi mesurer l'absorbance?

En biochimie, biologie ou chimie, lorsque l'analyte absorbe la lumière à une longueur d'onde spécifique, une relation unique existe entre l'atome/la molécule individuelle et son spectre UV Vis. Cette relation peut être utilisée pour:

• Analyse qualitative – déterminer la présence de certaines substances.
  Par exemple, déterminer les résidus de pesticides dans les aliments, identification de contaminations telles que la DCO dans l'eau, identification de l'acide nucléique tel que le test COVID-19.

• Analyse quantitative – déterminer les quantités de certaines substances.
  Par exemple, déterminer la concentration de substances dans l'air telles que les PM2,5, déterminer la concentration de substances nocives telles que le mercure et l'amiante dans le maquillage, mesurer la teneur en calcium et en protéines des produits laitiers.

3. Comment l'absorbance est-elle détectée?

• Source lumineuse
  L’élément le plus important pour la mesure de la transmission ou de l’absorption de la lumière est la source lumineuse..
  Différentes sources lumineuses peuvent être utilisées pour les mesures d'absorbance. Ils diffèrent par la plage de longueurs d'onde spectrales, dans leur intensité optique et dans leur stabilité à la lumière.

• Le blanc approprié
  Afin de corriger l'absorbance indésirable des mesures d'absorbance, comme la diffusion de la lumière, un blanc est mesuré parallèlement aux échantillons. Le blanc approprié comprend tous les composants à l'exception de l'analyte du test.
  Note latérale: Les particules dans les solutions diffusent la lumière, cela augmentera la valeur d'absorbance mesurée car ils bloquent le chemin de la lumière, par conséquent, moins de lumière atteint le détecteur.
• Détecteur de mesures d'absorbance
  Un spectrophotomètre UV-VIS est un instrument conçu pour mesurer l'absorbance dans la région UV-VIS en utilisant la loi de Beer-Lambert.. Mesure l'intensité de la lumière traversant une solution échantillon dans une cuvette et la compare à l'intensité de la lumière avant de traverser l'échantillon.

4.Contexte théorique des mesures d'absorbance

• Chemin de détection en cuvettes
  Une solution contenant des analytes intéressés avec des caractéristiques d'absorbance connues est placée dans une cuvette. Insérez ensuite la cuvette dans la chambre de l'instrument, le lecteur d'absorbance déterminera l'absorbance de la lumière en calculant la différence de densité optique avant et après le passage de l'échantillon.
  (La lumière qui ne traverse pas le détecteur est soit absorbée, soit dispersé. La partie dispersée peut être corrigée en mesurant les blancs appropriés, et est soustrait de cette valeur pour obtenir l'absorbance réelle de la substance intéressée.)

• Absorbance en chimie et sciences de la vie
  Après la mesure de l'absorbance, le résultat est une valeur donnée soit en transmission, soit en densité optique. Alors que, la quantification d'une substance en solution est le but de la mesure, alors la question évidente est de savoir comment convertir le signal connu en valeur de concentration. En général, nous pouvons utiliser la loi Beer-Lambert pour l'obtenir.
• Loi Bière-Lambert
  Le Loi Beer-Lambert est très utile car il permet la quantification des substances absorbantes sans qu'il soit nécessaire d'ajouter d'autres réactifs, il décrit la relation d'absorbance, longueur du trajet et concentration d'une substance absorbante:
  A=εlc
  A – absorbance
  ε – coefficient d'atténuation molaire ou capacité d'absorption de l'espèce atténuante – M‾¹cm‾¹
  l – longueur du trajet optique – cm
  c – concentration des espèces atténuantes- M

Il dit qu'il existe une relation linéaire entre la concentration, absorbance, longueur du trajet et coefficient optique molaire, qui permet de calculer la concentration de la solution en mesurant son absorbance.
Par exemple, dans une cuvette standard, la longueur du trajet est 1 cm. Pour une substance absorbante et une longueur d'onde spécifique, le coefficient d'extinction (e) est une constante spécifique, généralement le maximum d'absorbance de la substance, qui fournit des informations sur la force avec laquelle la substance spécifique absorbe la lumière à la longueur d'onde spécifique.
A titre d'exemple, le coefficient d'extinction molaire des oligonucléotides est 32.4 µl*cm-1*µg-1. Donc, une solution de 1 µg/µl d’oligonucléotides avec une longueur de trajet de 1 cm a une absorbance de 32.4 DE.

5.Qu'est-ce qui affectera vos mesures d'absorbance?

• Le matériau de la cuvette affecte-t-il l'absorbance?
  Lors de mesures dans la plage UV, comme il est nécessaire pour les acides nucléiques ou le NADH, la cuvette transparente aux UV est nécessaire pour terminer la mesure. Sinon, vous obtiendrez l'absorbance maximale dans tous les échantillons dans cette mesure d'absorbance car le matériau de la cuvette absorbe la lumière UV.

Nous avons divers matériaux de cuvette, et il y a 5 matériel commun que vous pouvez choisir d’utiliser, Plastique, Verre, Quartz UV (Une tige-1-1), VISQuartz (Une eau-2-2), Quartz IR (JGS-3) cuvette, le même matériau a le même spectre de transmission, mais une fabrication différente a une transmission de la lumière différente.
A titre d'exemple, pour notre cuvette en verre de quartz JGS-1, Collé la cuvette a 80% transmission de la lumière, mais le Tous fusionnés la cuvette de quartz a 83% transmission de la lumière, et la température applicable la plus élevée n'est pas la même.

• La taille de la cuvette affecte-t-elle l'absorbance?
  Selon la loi Beer-Lambert, lorsque le coefficient d'extinction (e) et la longueur du chemin (je) sont constants, l'absorbance (UN) est proportionnel à la concentration (c) de l'échantillon. Quand le ε et le c sont constants, l'absorbance est directement proportionnelle à la longueur du trajet lumineux, elle est également égale à la largeur intérieure de la cuvette.
  La longueur du trajet affecte l'absorbance. Avec une longueur de chemin optique plus longue, la lumière doit traverser plus de solution, et peut toucher plus de molécules ou d'atomes, et être absorbé davantage.
  Pour un échantillon à faible concentration, les analytes peuvent ne pas absorber suffisamment de lumière avec une cuvette à trajet court, alors la mesure est moins efficace.
• Le volume de l'échantillon affectera-t-il l'absorbance ?
  Pour une cuvette standard, remplir la cuvette environ 80% plein de la solution que vous souhaitez tester suffit.
  Mais pour une microcellule à quartz ou une cuvette à flux, et l'échantillon que vous utilisez est suffisamment petit pour 10-400ul, il est alors important de s'assurer qu'il y a suffisamment d'échantillon dans la cuvette pour que la lumière puisse passer à travers. Comme nous l'avons dit auparavant, la mesure sera moins efficace si l’analyte ne peut pas absorber suffisamment de lumière.
• La dimension Z affectera-t-elle l'absorbance?
  8.5MM, 15MM, 20mm La dimension Z correspond à la distance commune entre la fenêtre centrale de la cuvette et le fond de la cuvette.
  Si vous utilisez une cuvette à paroi noire ZD de 15 mm sur une machine de hauteur Z de 8,5 mm, le faisceau lumineux sera trop faible pour transmettre le mur noir de la cellule, qui ne peut pas atteindre le récepteur car il est bloqué, alors tu auras 0% transmission de la lumière.

  Nous avons des variétés de cuvettes d'absorption avec différents ZD indiqués ci-dessous, comme la longueur de trajet standard, trajet long, ou cellule à circulation.

  Hauteur Z	Type1	Code1	Longueur du trajet1	Tome1	Type2	Code2	Longueur du trajet2	Tome2
  8.5/15/20MM		QM79	10MM	50ul		QB41	10MM	100ul
  8.5MM		QB35	10MM	32ul		QF75	20MM	64ul
  15MM		QB44	10MM	50ul		QB43	10MM	200ul
  15MM		QM56	1/1.5/2/2.5/5/6.5MM	2/3/4/5/10/13ul		QB20	10MM	50/100/200ul

  Il y a plus de cuvettes auto-masquantes, s'il vous plaît, rendez-vous sur notre la toile ou Contactez-nous pour devis si vous souhaitez acheter des cellules.

Généralement, ce sont des bulles d'air dans l'échantillon, condensation sur un couvercle, poussière, rayures ou empreintes digitales sur la fenêtre de la cuvette. Donc, il est recommandé de vérifier la cuvette juste avant la mesure.
Nous disposons d'une cuvette New-Arrival sans bulles pour réduire l'influence des bulles d'air dans la mesure.

• Comment le pH affecte-t-il l'absorption de la lumière?
  Lorsque le pH de la solution change, il y a une ionisation dans certaines molécules de la solution, puis la structure des changements moléculaires, ce qui affectera la détermination de l’absorbance.
  A titre d'exemple, pour la mesure des anthocyanes du lycium ruthenicum, il est moins précis si l'on mesure la concentration d'anthocyanes dans un environnement à pH unique, car leur couleur et leur absorbance changent avec le pH.

Par conséquent, La méthode du pH différentiel est un meilleur moyen de déterminer la concentration d’anthocyanine du lycium ruthenicum.

• La température affecte-t-elle l'analyse de l'absorbance UV Vis?
  La température affecte les valeurs d'absorbance.
  Les performances d’interaction des différents solvants ne sont pas exactement les mêmes à différentes températures. Il est essentiel pour une mesure efficace de contrôler la température de chauffage, en particulier certaines réactions se déroulant à une température spécifique.. Les paramètres de la solution changeront avec les changements de température:

  Vitesse de réaction-La vitesse de réaction change lorsque la température change. Cela peut entraîner un changement dans l'activité de l'échantillon. Les réactions enzymatiques/biomoléculaires sont très sensibles à la température.
  Solubilité d'un soluté-La solubilité est affectée par les variations de température. Une mauvaise solubilité peut entraîner une absorption imprécise.
  Expansion ou contraction du solvant-Cela peut entraîner une modification de la concentration de la solution et affecter l'absorbance., car l'absorbance est linéairement liée à la concentration.
  Effet de traînée-Cet effet peut se produire avec des changements de température, conduisant à une série de courants convectifs qui peuvent modifier la véritable absorbance.

Pour la mesure de l'azote total dans l'eau avec un spectrophotomètre, en solution aqueuse alcaline (>60℃), Le persulfate de potassium peut être décomposé pour produire du bisulfate de potassium et de l'oxygène atomique, puis le NO2-, NH4-, l'azote organique présent dans l'échantillon peut être oxydé en azote nitrate par l'oxygène atomique à 120-124 ℃. Et nous pouvons déterminer l'absorbance et la concentration avec cette solution.

Mais il y aura du persulfate de potassium résiduel dans la solution pour affecter l'absorbance si la température contrôlée ne répond pas aux exigences.. Le persulfate de potassium a un fort pic d'absorption à 220 nm, qui coïncide avec la longueur d'onde d'absorption de l'azote total. Cette caractéristique d'absorption s'affaiblit progressivement avec la diminution continue du persulfate de potassium..

Le contrôle de la température peut être obtenu à l'aide d'un système nomothermique haute performance pour la spectrophotométrie UV Vis.

• Comment la lumière parasite affecte-t-elle la densité optique (DE) en lisant?
  La lumière parasite est définie comme la lumière dans le système à des longueurs d'onde (couleurs) autre que celui prévu, c'est à dire, la lumière parasite ne provient pas de la source lumineuse de l’instrument et ne suit pas le chemin optique mais atteint le détecteur, ce qui provoque une déviation à la longueur d'onde correspondante.

  Donc, la densité optique mesurée par le détecteur est supérieure à la véritable DO. Autrement dit, l'absorbance mesurée des échantillons est inférieure à l'absorbance réelle en raison de la contribution de la lumière parasite.
  Il existe une méthode pour réduire la lumière parasite dans ces systèmes : utiliser des monochromateurs doubles..

6. Comment réduire l'effet sur l'absorbance comme mentionné ci-dessus?

Comme nous l'avons dit auparavant, différentes mesures d'absorbance nécessitent un contrôle environnemental différent du pH et de la température, et la lumière parasite est un sujet complexe pour déterminer le problème exact à résoudre.

Dans cette partie, nous allons résoudre les facteurs d'influence de la cuvette pour l'absorbance, choisir la bonne cuvette, utilisation et entretien des cuvettes:

• Comment choisir la bonne cuvette d'absorption pour les études d'absorbance?
  Dans notre article précédent, 7 Choses à penser lors de la commande d'une cuvette, nous avons tenté d'apporter des réponses pour choisir la bonne cuvette, il est spécifié dans les aspects du matériau de la cuvette, longueur du trajet, Dimension Z, volume, type de couverture, forme des cellules, etc..
  Il y aura une explication plus détaillée sur le choix de la longueur du trajet de la cuvette dans la partie suivante:

• Comment choisir la bonne longueur de trajet de cuvette?
  La longueur de trajet appropriée de la cuvette est de garantir que les valeurs d'absorbance se situent dans la plage dynamique du détecteur..
  Le choix de la longueur du trajet optique de la cuvette dépend de la concentration d'un échantillon et de la chambre de l'instrument, qui décident de la longueur du trajet lumineux supérieur de détection.

• À quelle heure utiliseront les cuvettes « long trajet »?
  Lorsque la concentration de l'échantillon est trop faible pour être mesurée à l'aide d'une cellule standard de 10 mm de longueur de trajet optique, et la concentration est difficile dans les cas où l'échantillon se vaporise ou subit un changement structurel chimique ou moléculaire pendant le processus de concentration, Ensuite, une cellule avec une longueur de trajet optique plus longue est utilisée pour permettre une sensibilité d'absorption optimale de la mesure d'absorption..

Par exemple, une étude bien connue utilisant une cellule à longue longueur de trajet est l'analyse de la turbidité de l'eau. 50les cuvettes mm et 100 mm sont souvent utilisées pour analyser des échantillons à faible turbidité.

Il existe des cuvettes avec une longueur de trajet optique de 20 mm, 30MM, 40MM, 50MM, 100MM, et autres cellules à long trajet, en Quartz JGS1, 200-2500nm.

Nous disposons également de cuvettes à longue longueur de trajet en verre optique, ça va de 10 à 100 mm. Cliquez ici pour en voir plus, et ici pour voir le Collé* .

• Quand utilisera-t-on des cuvettes « à court trajet » ??
  En ce qui concerne certains haute concentration échantillons, il permet la mesure avec une cellule de longueur de trajet standard de 10 mm après dilution.
  Mais pour certains échantillons à haute concentration, il ne peut pas être dilué facilement., Par exemple, car l'analyte peut interagir avec le solvant, la dilution d'un échantillon peut entraîner une modification de l'absorbance (c'est-à-dire, décalage dans les longueurs d'onde maximales). Dans ce cas, une cuvette à trajet court est utilisée pour mesurer des échantillons à haute concentration sans les diluer efficacement.

Par exemple, Une étude bien connue utilisant une cellule à trajet court est l'analyse de solution dans la région NIR.. Si une cellule de longueur de trajet standard de 10 mm est utilisée pour la mesure de l'absorbance dans la région NIR, la saturation se produit souvent parce que l'absorption de la lumière par le solvant, rendant impossible la détermination de l'absorption de l'analyte. Ensuite, une cellule à trajet court est utilisée pour éviter la saturation de l'absorption à cause du solvant..

Il existe des cellules à trajet court avec des longueurs de trajet optique de 0,1 mm, 0.2MM, 0.5MM, 1MM, 2MM, 5MM, et etc..

Nous disposons également de cuvettes à trajet court avec fenêtre macro, hermétique, ou largeur étroite comme ci-dessous.

Nous avons davantage de cuvettes à trajet court, comme 1,5 mm, 2.5MM, 3MM, 6MM, et une cuvette en verre optique est également en stock.

Si vous souhaitez acheter une cuvette de qualité et abordable, s'il te plaît Contactez-nous ou allez sur notre site internet ecuvette.com.

Après avoir étudié le choix du matériau dans la cuvette, longueur du trajet, volume, Z-Dimension et j'ai commandé la bonne cuvette, il est temps pour nous d'apprendre à nettoyer la cuvette si nous n'avons pas acheté la cuvette jetable.

• Comment nettoyer la fenêtre extérieure de la cuvette?
  La cuvette doit être remplacée immédiatement en cas de fissures, éclats ou rayures sur la fenêtre, ou entraîner de mauvaises performances, résultat moins efficace et perte de votre échantillon et de votre temps, c'est beaucoup plus cher que le coût d'une cuvette remplacée.

En fin de journée, nettoyez soigneusement vos cuvettes, Séchez-les complètement à l'air et conservez-les dans un support à cuvettes ou dans un autre récipient approprié.. Si les cuvettes ne sont pas complètement sèches et sont conservées humides, ils peuvent sécher avec un échantillon de résidus d'application précédente sur les surfaces de mesure, ce qui affectera les mesures ultérieures.